Purification and characterization of cysteine-43 mutant citrate synthase from Thermoplasma acidophilum

• Published in: Turkish journal of biology Vol. 23; no. 4; pp. 423 - 431
• Main Authors: ERDURAN, İpek, KOCABIYIK, Semra
• Format: Journal Article
• Language: English
• Published: TÜBİTAK 1999
• Subjects: bacteria; bakteriler; Biochemistry and Physiology of Microorganisms; Biotechnology; Biyoteknoloji; bölge-yönlendirilmiş mutasyon; characterization; citrate synthase; enzim aktivitesi; enzyme activity; Genetics and Molecular Biology of Microorganisms; karakterizasyon; kinetics; kinetik; Mikroorganizmaların Biyokimyası ve Fizyolojisi; Mikroorganizmaların Genetiği ve Moleküler Biyolojisi; purification; saflaştırma; SDS-PAGE; sıcaklığa dayanıklılık; site-directed mutagenesis; sitrat sentaz; temperature resistance; Thermoplasma acidophilum
• ISSN: 1300-0152; 1303-6092

Thermoplasma acidophium sitrat sentaz enziminin seçilmiş iki pozisyonuna (ser-309 ve Ser-43) iki sistin grubu yerliştirimiştir. Serin 309 Sistin mutasyonu enzimin termostabilitesi kadar aktivitesini de büyük ölçüde azatmıştır. Serin 43 Sistin mutasyonu her ne kadar enzimin aktivitesini azaltmışsa da termostabiliteyi etkilememiştir. Hem mutant olmayan, hem de Sistin-43 mutant Thermoplasma sitrat sentaz enzimeri Matrex Gel Red A kullanılarak yapılan afinite kromatografi ile homojen bir şekilde safaştırılmıştır. Sistin-43 mutant Thermoplasma sitrate sentaz enzimi mutant olmayan sitrat sentaz enzimine moleküler ağırlığı, substrat ve ko-faktör spesifisitesi, pH profili ve ısıya dayanıklılık bakımından çok benzemektedir. Mutasyonun sonucu olarak sitrat sentaz enziminin spesifik aktivitesinde görülen azalma, Vmax ve Ea değererine de yansımaktadır.
Two cysteine residues were introduced to selected positions (Serine-309 and Serine-43) of the Thermoplasma acidophilum citrate synthase. Serine-309 Cysteine mutation drastically reduced the activity, as well as the thermostabiity of the enzyme. Although Serine-43 Cysteine mutation reduced the enzyme activity, it did not have any effect on the thermostability. Both wild-type and cysteine-43 mutant Thermoplasma citrate synthase enzymes were purifıed to homogenity using affinity chromatography on Matrex Gel Red A. The cysteine-43 mutant Thermoplasma citrate synthase was strikingy similar to the wild-type recombinant citrate synthase in its molecular size, substrate and co-factor specificities, pH profile and thermal resistance. The decrease in the specific activity of the citrate synthase as a result of this mutation was reflected by V and E values.