Dissecting the Pathogenesis of Machado-Joseph Disease in a New Human Disease Model Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

• Main Author: dos Santos Onofre, Isabel Maria
• Format: Dissertation
• Language: English
• Published: ProQuest Dissertations & Theses 01-01-2015
• Subjects: Aging; Cellular biology; Neurodegeneration; Neurosciences; Pathology; Stem cells
• ISBN: 9798383773666

A doença de Machado-Joseph, também conhecida por ataxia espinocerebelosa tipo 3, é a ataxia autossómica dominante mais comum a nível mundial. A DMJ é uma doença neurodegenerativa de início tardio causado por uma expansão de CAGs na região codificante do gene ATXN3localizado no cromossoma 14q32.1, sendo a mutação traduzida numa cadeia de poliglutaminas anormalmente longa na proteína ataxina-3.Com o desenvolvimento das células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs), o estudo da patologia da MJD deixou de estar restrito a modelos de doença artificiais, tais como modelos animais ou linhas celulares, que apresentam limitações como modelos de doenças neurodegenerativas. Nesse sentido, nesta tese, o nosso objectivo foi o de desenvolver um novo modelo in vitro humano para estudar a DMJ.Esta tese está organizada em 4 capítulos. No capítulo 1, é feita uma revisão acerca das principais características patológicas da MJD e também uma revisão acerca de modelos in vitroderivados de células estaminais pluripotentes induzidas.No capítulo 2 é descrito o desenvolvimento e investigação do fenótipo DMJ em fibroblastos adultos da derme de doentes. As culturas foram caracterizadas geneticamente e o fenótipo DMJ foi estudado neste tipo particular de células não-neuronais, atendendo à disfunção autofágica. Foi encontrada uma disfunção da autofagia relacionada com o fenótipo DMJ, em particular, níveis reduzidos de beclina-1 e redução de formação de autofagossomas.No capítulo 3, reportamos o sucesso da geração de iPSCs a partir das culturas de fibroblastos da derme previamente estabelecidas. Foi utilizado um vector lentiviral para expressar os 4 factores de reprogramação (Sox2, Oct4, Klf4 e c-Myc) na reprogramação dos fibroblastos humanos adultos da derme. A pluripotência destas células foi totalmente caracterizada, atendendo aos critérios de morfologia, marcadores moleculares, como a actividade da fosfatase alcalina, expressão de marcadores de superfície e de factores de transcrição nucleares e de genes associados à pluripotência celular; e de ensaios funcionais, particularmente os ensaios de diferenciaçãoin vitro e in vivo. Verificámos ainda que estas células mantiveram o cariótipo diploide e o genótipo da doença, apresentando-se em perfeitas condições para serem diferenciadas em culturas neuronais de DMJ.No capítulo 4 é descrita a diferenciação das iPSCs em neurónios específicos de doentes e um estudo da patogénese da DMJ. Verificámos que a autofagia está comprometida em culturas precoces de neurónios DMJ, fornecendo evidência de que a desregulação dos mecanismos de clearance de proteínas é um evento precoce na DMJ. Verificámos ainda que a localização subcelular da ataxina-3 é alterada na presença de níveis aumentados de Ca2+em neurónios MJD, deslocando-se do citoplasma para o núcleo, onde foi detectada na forma de pequenos agregados.Em conclusão, esta tese evidencia que as iPSCs obtidas de doentes DMJ são uma ferramenta poderosa no contexto de modelação da doença, criando a oportunidade única de gerar neurónios específicos de doentes DMJ e o estudo da doença. Além disso, os nossos resultados demonstram ainda que os neurónios humanos obtidos por diferenciação são uma plataforma para estudos futuros de novas terapêuticas e desenvolvimento de fármacos.