Differentielle Regulation p65-abhängiger Systeme

• Main Author: Srebrzynski, Anna
• Format: Dissertation
• Language: German
• Published: ProQuest Dissertations & Theses 01-01-2012
• Subjects: Binding sites; Biochemistry; Bioinformatics; DNA methylation; Enzymes; Gene expression; Genetics; Genomes; Herpes viruses; Kinases; Proteins; Transcription factors; Tumor necrosis factor-TNF
• ISBN: 9798744492335

Die konditionelle Expression von Transgenen stellt ein unersetzliches Werkzeug für das Studium der Genexpression sowohl in der normalen Entwicklung als auch in der Pathogenese eines Organismus dar (Gossen & Bujard, 2002; Stieger et al., 2009; Weber & Fussenegger, 2007). Das in der vorliegenden Arbeit eingesetzte Tet-System verwendet hierzu Fusionsproteine, die auf einem bakteriellen Transkriptionsfaktor, dem Tet Repressor, basieren (Berens & Hillen, 2003)(Berens & Hillen, 2003)(Berens & Hillen, 2003). Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen dem von NFκB abgeleiteten reversen Transaktivator rtTASM2(p65) und dem Transsilencer tTSD-I(KRAB), mit einer aus Kox1 stammenden KRAB-Domäne. Die bereits beschriebene irreversible Repression eines Reportergens sowie dessen verminderte Aktivierbarkeit durch p65 in Anwesenheit von KRAB wurden durch Etablierung neuer Regulatorzelllinien auf die Kombination der beiden genannten Transregulatoren eingegrenzt. Die an tTS fusionierten Domänen C-Rest und TRα wurden als effiziente Repressionsmotive im genomisch integrierten Kontext identifiziert. Durch spezifische Inhibition Repression-vermittelnder Chromatinmodifikationen wurde die molekulare Wirkungsweise der KRAB-induzierten Repression analysiert. Sowohl in von HeLa als auch von Jurkat abgeleiteten Zelllinien wurde gezeigt, dass nach kombinierter Inhibition von Histonacetylierung und DNA-Methylierung, sowie nach Inhibition der durch Enzyme der SET-Familie vermittelten Histonmethylierung am KRAB-reprimierten Promotor die Bindung eines rtTA der Aufrechterhaltung einer repressiven Chromatinumgebung entgegenwirkt. Ohne diese zusätzliche Aktivierung findet Derepression nicht statt, die Repression durch KRAB ist in diesem Fall also irreversibel. Diese Analysen wurden sowohl an ausschließlich Tet-abhängigen Promotoren als auch an Promotoren durchgeführt, die durch das Tet-System sowie zusätzlich durch den zellulären NFκB-Signalweg reguliert werden. Hierbei erwies sich der das Repressionsmotiv PLDLS tragende tTSD-I(PP) auf Grund seiner jederzeit reversiblen Repression als geeigneteres Instrument zur konditionellen Regulation. Es wurde gezeigt, dass ein HIV-1 LTR durch tTSD-I(PP) reversibel reprimierbar ist, während durch tTSD-I(KRAB) irreversible Abschaltung stattfindet. Dies impliziert eine natürliche Funktion der KRAB-Domäne, die in der dauerhaften Repression retroviraler Elemente in infizierten Wirtszellen bestehen könnte. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit bestand in der Optimierung von rtTASM2(p65). Die Erweiterung des p65-Anteils in N-terminaler Richtung um die Wildtypsequenz und damit die Proteinkinase-A-Konsensus-Phosphorylierungsstelle an Ser276 führte zu keiner verbesserten Aktivierung. Auch konnte die Phosphorylierung des Aminosäurerests Ser276 nicht nachgewiesen werden. Durch Mutagenese der in p65 enthaltenen Kernexportsequenz NES wurde der neue rtTASM2(p65ΔNES) generiert, der gegenüber dem ursprünglichen rtTA verbesserte Transkativierungseigenschaften besitzt. Diese korrelieren mit der vermehrten nukleären Akkumulation des Transaktivators, die mittels Immunhistochemie nachgewiesen wurde.