Dosagem de cortisol e cortisona livres urinários empregando cromatografia líquida associada a espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS)

• Published in: Arquivos brasileiros de endocrinologia e metabologia Vol. 49; no. 2; pp. 291 - 298
• Main Authors: Vieira, José Gilberto H., Nakamura, Odete H., Carvalho, Valdemir M.
• Format: Journal Article
• Language: English
• Published: 01-04-2005
• ISSN: 0004-2730; 0004-2730
• DOI: 10.1590/S0004-27302005000200017

A dosagem de cortisol livre na urina (CLU) é um método útil na triagem de pacientes suspeitos de síndrome de Cushing. Os imunoensaios atuais apresentam limitações que dificultam sua aplicação e a comparação de resultados por diferentes ensaios. No presente método para dosagem de cortisol e cortisona livres urinários, baseado em cromatografia líquida com detecção por espectrômetro de massa em tandem (LC-MS/MS), uma alíquota de urina 24h (200µL) é misturada com solução contendo quantidade conhecida de cortisol deuterado e extraída on-line em fase sólida (C18). O eluato é transferido para uma segunda coluna C18 (Phenomenex Luna, 3µ, de 50 x 2mm), e o eluato obtido em modo isocrático é aplicado diretamente no MS/MS modelo Quattro Micro, operando no modo positivo de ionização química a pressão atmosférica (APCI). Todo o processo é automatizado e a quantificação é feita por diluição isotópica com base nas razões das áreas dos picos dos analitos e do padrão interno deuterado. O estudo de especificidade mostrou que nenhum esteróide testado apresenta reatividade cruzada superior a 1% com cortisol ou cortisona. A sensibilidade funcional é <1µg/L para os dois esteróides, e o CV interensaio <8%. Os estudos de recuperação e de linearidade foram satisfatórios, e a comparação entre os resultados obtidos para cortisol em 98 amostras de rotina, pelo ensaio em estudo e por um RIE, mostraram correlação de r= 0,838, sendo os valores obtidos por LC-MS/MS significativamente mais baixos (medianas de 22,0 e 49,4µg/24h, respectivamente) (P<0,0001). Os valores de referência para cortisol foram definidos entre 11 e 43µg/24h, compatíveis com métodos semelhantes recentemente descritos. A dosagem concomitante de cortisona livre urinária permite o estudo da atividade da enzima 11beta-HSD2 e a pesquisa da síndrome do excesso aparente de mineralocorticóides. O método descrito representa a primeira descrição, em nosso meio, de uma nova geração de métodos para a medida de esteróides hormonais, baseados em processos preparativos automatizados e leitura por espectrometria de massa em tandem.
Free urinary cortisol (UFF) measurement is one of the most useful screening tests for Cushing's syndrome. Immunoassays employed today by most clinical laboratories present limitations, specially concerning specificity. These limitations restrain a widespread application of the method, as well as the comparison of results obtained by the use of different methods. We present the development and characterization of a UFF and cortisone method based on liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). A 200µL aliquot from a 24h urine sample is mixed with a solution containing a known quantity of deuterated cortisol and on-line extracted in solid phase (C18). The eluate is transferred to a second C18 column (Phenomenex Luna, 3µ, 50x2 mm) and the isocratic mode elution profile is directly applied to a tandem mass spectrometer model Quattro Micro operating in positive mode atmospheric pressure chemical ionization (APCI). All process is automated and the quantification is performed by isotopic dilution, based on the analyte and the deuterated internal standard peak area ratios. The specificity study showed that all the steroids tested presented cross reactivity of <1% for cortisol and cortisone. Functional sensitivity is <1µg/L for both steroids, and the interassay CV <8%. Recovery and linearity studies were satisfactory and comparison of results obtained using a RIA for UFF and the present method in 98 routine samples showed a correlation of r= 0.838, with the results obtained with LC-MS/MS significantly lower (medians of 22.0 vs. 49.4µg/24h for RIA) (P<0.0001). Reference values for cortisol were defined as values between 11 and 43µg/24h, compatible to those recently described for similar methods. The concomitant measurement of UF cortisone allows the study of the activity of the enzyme 11beta-HSD2 and the diagnosis of the apparent mineralocorticoid excess syndrome. The method represents the first steroid assay of a new generation, based on automated preparative methods and tandem mass spectrometry, described in our country.