DEZVOLTAREA UNUI VACCIN ARN MESAGER – ANTIGENE MODEL

• Published in: Romanian archives of microbiology and immunology Vol. 81; pp. 39 - 40
• Main Authors: Tălpău, Mădălina, Ţucureanu, Cătălin, Costache, Adriana-Zoe, Tofan, Vlad, Dumitraşcu, Andrei, Ionescu, Irina-Elena, Şerbănescu, Ana-Daniela, Ermeneanu, Andreea-Laura, Stăvaru, Crina, Onu, Adrian
• Format: Journal Article
• Language: English; Romanian, Moldovan
• Published: Bucharest Institutul Cantacuzino 01-11-2022
• Subjects: Antigens; Bone marrow; Cloning vectors; Dendritic cells; DNA-directed RNA polymerase; E coli; Gene expression; Hemagglutinins; Influenza; mRNA vaccines; Oligonucleotides; Plasmids; Polymerase chain reaction; Protein expression; Proteins; RNA modification; RNA polymerase; Transcription; Vaccine development; Romania; Bucharest Romania
• ISSN: 1222-3891; 2601-9418

Obiective. Scopul acestei lucrări constă în obţinerea unor vectori de clonare / transcripţie în vitro, asamblarea şi testarea unor secvenţe de ARN mesager pentru dezvoltarea unor vaccinuri ARNm model. S-a urmărit modificarea unor plasmide comerciale prin introducerea unor elemente de control non-codante în regiunile 5' şi 3' şi adaptarea regiunii promotor pentru a permite transcripţia in vitro a ARNm. A fost evaluat efectul elementelor non-codante şi al optimizărilor de secvenţa asupra nivelului de expresie proteică in vitro. Materiale şi metode. Secvenţele sintetice au fost asamblate prin fuziune de oligonucleotide cu suprapunere completă sau parţială şi introduse în vectori prin OE-PCR (Overlap Extension Polymerase Chain Reaction) pe baza unor regiuni complementare. Verificarea plasmidelor obţinute a fost făcută prin restricţie enzimatică şi secvenţiere. Adaugarea regiunii poly-A în capătul 3' al secvenţelor de interes a fost făcută prin restricţie / ligare din oligonucleotide sintetice. Plasmidele au fost multiplicate în bacterii competente E. coli TOP10, purificate şi liniarizate enzimatic. Transcripţia in vitro a ARN mesager a fost făcută cu ARN polimeraza T7 iar adăugarea structurii 5'-Cap a fost efectuată co-transcripţional. Expresia antigenelor model a fost testată pe celule eucariote (HEK293T şi celule dendritice derivate din măduvă osoasă murină). Rezultate şi concluzii. Au fost obţinuţi vectori pentru transcripţia in vitro a ARNm codificator pentru antigenele model EGFP ("enhanced green fluorescence protein") şi HA-ECTO (hemaglutinina virusului gripal PR8) cu diferite optimizări de secvenţă în vederea creşterii nivelului de expresie proteică. Optimizarea ARNm codificator EGFP pentru creşterea probabilităţii de formare a unor structuri secundare stabile în 3' a condus la o expresie proteică mai puternică în comparaţie cu secvenţa optimizată doar pentru utilizarea codonilor. Sursa de finanţare: Studiul a fost efectuat în cadrul proiectului PSCD: „Platforma de dezvoltare vaccinuri ARN" (ARMARNVACC).