Biološka i Molekularna Karakterizacija Virusa Mozaika Krastavca (Cucumber Mosaic Virus) u Srbiji

• Main Author: Milojević, Katarina N
• Format: Dissertation
• Language: Serbian
• Published: ProQuest Dissertations & Theses 01-01-2016
• Subjects: East European Studies; Genes; Genetics; Haplotypes; Phylogenetics; Slavic Studies; Systematic biology; Virology; Viruses
• ISBN: 9798383114537

Serološkim analizama primenom DAS-ELISA testa, u periodu od 2010. do 2013. godine, prisustvo virusa mozaika krastavca (Cucumber mosaic virus, CMV) utvrđeno je u 29,68% testiranih uzoraka poreklom iz 32 različite vrste, varijeteta ili sorte povrtarskih, industrijskih, ukrasnih i korovskih biljaka sa 74 lokaliteta. U okviru ovih ispitivanja Tulipa sp. i Peperomia tuisana prvi put su otkrivene kao domaćini u našoj zemlji, a Wisteria sinensis i Stenactis annuasu otkrivene kao novi domaćini CMV ne samo kod nas, već i u svetu.Analiza genetičke strukture prirodne populacije CMV u Srbiji na osnovu biološke i molekularne karakterizacije obuhvatila je 44 odabrana izolata poreklom sa različitih biljnih vrsta, njihovih varijeteta ili sorti sakupljenih na 30 lokaliteta tokom ovih istraživanja, kao i izolate iz prethodnih istraživanjanja iz perioda 2007-2009. godine. Molekularna karakterizacija na osnovu analize sekvence CP gena obuhvatila je 44 izolata, dok su molekularna proučavanja na osnovu analize sekvenci 2a, 2b i MP gena obuhvatila 19 izolata, a 1a gena 15 izolata CMV. Tokom ovih istraživanja uspostavljeni su ili unapređeni protokoli za amplifikaciju svih pet genskih regiona izolata CMV poreklom iz naše zemlje.Stepen nukleotidne i aminokiselinske sličnosti, kao i filogenetske analize pokazale su varijabilnost prirodne populacije CMV u Srbiji kod četiri od pet genskih regiona. Najveća varijabilnost utvrđena je analizom dela 1a gena (grupisanje u tri podgrupe, IA, IB i II), delova MP i CP gena kao i celog 2b gena (grupisanje u dve podgrupe, IA i II), dok je analiza dela 2a gena pokazala homogenost populacije CMV i grupisanje svih ispitivanih izolata u IA podgrupu. Na osnovu filogenetskih analiza sekvenci pojedinačnih genskih regiona RNK 1, 2 i 3, kao i sekvenci RNK 3 i RNK 2 segmenta utvrđeno je prisustvo rekombinantnih i pseudorekombinantnih izolata u populaciji ovog virusa u Srbiji i identifikovano šest različitih haplotipova. Najveći broj izolata po svim genskim regionima pripada IA podgrupi (haplotip: IA; IA-IA; IA-IA). Po brojnosti sledi haplotip: II; IA-II; II-II zastupljen sa tri izolata, dok su preostala četiri haplotipa utvrđeni kod pojedinačnih izolata (haplotip: IA; IA-IA; IA-II, haplotip: IB; IA-IA; IA-IA, haplotip: II; IA-IA; II-II i haplotip: IB; IA-II; IA-IA). Ni jedan od ispitivanih izolata po svim genskim regionima ne pripada IB ili II podgrupi.Primenom RFLP analize „in silico“ odabrani su restrikcioni enzimi tako da je uspostavljen brz i pouzdan protokol za karakterizaciju CMV. RFLP analizom „in situ“ potvrđeno je filogenetsko grupisanje, a isključeno je prisustvo mešanih infekcija i time potvrđeno postojanje rekombinantnih i pseudorekombinantnih izolata u Srbiji.Primenom RDP softvera analizirane su sekvence RNK 2 segmenta i potvrđeno je da su četiri izolata prirodni rekombinanti između IA (2a gen) i II (2b gena) podgrupa, a analiza sekvenci RNK 3 segmenta potvrdila je da je jedan izolat prirodni rekombinant između IA (MP gen) i II (CP gen) podgrupa CMV. Analiza prirodne selekcije, primenom „codon-based“ Z-testa, pokazala je da na sve testirane genske regione i parove sekvenci CMV deluje negativna selekcija, sa izuzetkom jednog para sekvenci CP gena, na koji utiče slaba pozitivna selekcija.Biološka karakterizacija ukazala je na priličnu fenotipsku varijabilnost populacije CMV u Srbiji, pri čemu nije bilo moguće povezati fenotipske osobine sa genotipskim razlikama između podgrupa ispitivanih izolata.Po prvi put u Srbiji, detektovano je prisustvo satRNK CMV koja je ispoljila genetičku varijabilnost. Dva izolata satRNK CMV se na osnovu filogenetksih analiza grupišu sa nekrogenim izolatima, a jedan sa običnim izolatima satRNK CMV.Rezultati ovih istraživanja predstavljaju prva detaljnija saznanja o strukturi populacije i genetičkom diverzitetu CMV u našoj zemlji, kao i o evolutivnim mehanizmima koji oblikuju variranje i stepen promena u okviru populacije. Dobijeni rezultati omogućavaju dalji rad na izučavanju diverziteta ne samo ovog već i drugih ekonomski važnih fitopatogenih virusa u našoj zemlji.