REV1 Geninin DT40 Hücrelerinde “Knock Out” Edilerek Somatik Hipermutasyona Etkisinin Incelenmesi

• Main Author: Sarıbaşak, Nesibe Nur
• Format: Dissertation
• Language: Turkish
• Published: ProQuest Dissertations & Theses 01-01-2005
• Subjects: Biochemistry; Biology; Cellular biology; Genetics
• ISBN: 9798515214043

İmmünoglobulin (Ig) çeşitliliğine sebep olan başlıca 3 tane B lenfosit mekanizması vardır. Bunlar somatik hipermutasyon (SHM), Ig gen konversiyonu (GC) ve class switch rekombinasyonudur (CSR). Bu üç önemli mekanizmanın AID (Activation Induced Cytidine Deaminase) denilen bir protein ile kontrol edildiği yakın zamanda gösterilmiştir. Bu çalışmada, transversiyon mutasyonlarına sebep olduğu düşünülen REV1 geninin somatik hipermutasyonda görevi olup olmadığını anlamak için, DT40 hücrelerinde ""knock out"" edildi. Tavuk B lenfosit hücresi olan DT40 hücreleri; yüksek oranlarda hedef integrasyonu yaptığı için, genlerin diğer hücrelere göre daha kolay ""knock out"" edildiği, daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Öncelikle Rev1 geninin ekzonların yoğun olduğu bölge "knock out" için seçildi ve PCR yöntemi ile "knock out" vektörünün hedef kolları hazırlandı. Hedef kollar ve plazmiti hücrenin içerisinde ayırt edebilmek için ilaç direnç kasetleri, pBluescript plazmitine klonlandı ve daha sonra plazmitler linerize edilerek AID-/-R?Vr-E IgM (+) hücrelere transfer edildi REV1 geninin ""knock out"" edilip edilmediği hedef geni görüntüleme PCR reaksiyonu, FACS analizi ve dizi reaksiyonu ile kontrol edildi. Yapılan ""knock out"" sonucunda, bu hücrelerin normal DT40 hücrelerine göre çok yavaş büyüdüğü gözlendi. FACS analizleri, somatik hipermutasyonun AID-/-R?Vr-E IgM (+) hücrelere göre yaklaşık 3 kat azaldığını gösterdi. Azalan mutasyonların hangi tür mutasyonlar olduğunu anlamak için DNA dizi analizi yapılarak, analizlerin sonucunda REV1 geninin sebep olduğu düşünülen CþG veya GþC transversiyon mutasyonlarının çok büyük oranda azaldığı gözlendi. Bu sonuçlar REV1 geninin, DT40 hücrelerindeki SHM'da en fazla görülen transversiyon mutasyonlarının, hemen hemen tamamını azaltarak bu mekanizmada önemli olduğunu gösterdi.