Normalización de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la cuantificación del herpesvirus humano 8
OBJETIVO: normalizar un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para determinar la carga viral del herpesvirus humano 8, en diferentes muestras clínicas de pacientes en los que se sospeche la infección por este agente. MÉTODOS: se evaluaron 3 de los métodos reportados internaci...
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| Published in: | Revista cubana de medicina tropical Vol. 61; no. 2 |
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| Main Authors: | , , , , , , |
| Format: | Journal Article |
| Language: | Portuguese Spanish |
| Published: |
Centro Nacional de Información de Ciencias Médicas
01-08-2009
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| Subjects: | |
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| Abstract | OBJETIVO: normalizar un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para determinar la carga viral del herpesvirus humano 8, en diferentes muestras clínicas de pacientes en los que se sospeche la infección por este agente. MÉTODOS: se evaluaron 3 de los métodos reportados internacionalmente para obtener ADN estándar en la construcción de curvas externas estándar, que permiten determinar el número de copias de ADN diana en la muestra problema. RESULTADOS: se obtuvieron 3 ADN estándar a partir del clonaje de un fragmento del gen ORF26 del herpesvirus humano 8 en un vector (ADN plasmídico), con la utilización de productos purificados de reacción en cadena de la polimerasa y el empleo de ADN genómico de la línea celular BCBL. Se pudieron construir las curvas patrón a partir de cada uno de los ADN estándar obtenidos, los que mostraron una fuerte correlación lineal (r= -1) y valores muy bajos de error a lo largo de 6 magnitudes de concentración de ADN diana. El límite inferior de detección a partir del ADN plasmídico y de los productos de reacción en cadena de la polimerasa fue de hasta 100 copias, mientras que con el ADN genómico fue de hasta 10 copias; este último sistema resultó el más sensible. CONCLUSIONES: la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real normalizada a partir de los 3 ADN estándar probó ser un sistema rápido, específico y altamente sensible que permitirá un mejor diagnóstico y además desarrollar estudios sobre la patogenia de la infección por el herpesvirus humano 8 en Cuba. |
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| AbstractList | OBJETIVO: normalizar un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para determinar la carga viral del herpesvirus humano 8, en diferentes muestras clínicas de pacientes en los que se sospeche la infección por este agente. MÉTODOS: se evaluaron 3 de los métodos reportados internacionalmente para obtener ADN estándar en la construcción de curvas externas estándar, que permiten determinar el número de copias de ADN diana en la muestra problema. RESULTADOS: se obtuvieron 3 ADN estándar a partir del clonaje de un fragmento del gen ORF26 del herpesvirus humano 8 en un vector (ADN plasmídico), con la utilización de productos purificados de reacción en cadena de la polimerasa y el empleo de ADN genómico de la línea celular BCBL. Se pudieron construir las curvas patrón a partir de cada uno de los ADN estándar obtenidos, los que mostraron una fuerte correlación lineal (r= -1) y valores muy bajos de error a lo largo de 6 magnitudes de concentración de ADN diana. El límite inferior de detección a partir del ADN plasmídico y de los productos de reacción en cadena de la polimerasa fue de hasta 100 copias, mientras que con el ADN genómico fue de hasta 10 copias; este último sistema resultó el más sensible. CONCLUSIONES: la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real normalizada a partir de los 3 ADN estándar probó ser un sistema rápido, específico y altamente sensible que permitirá un mejor diagnóstico y además desarrollar estudios sobre la patogenia de la infección por el herpesvirus humano 8 en Cuba. |
| Author | Martínez Rodríguez, Pedro Ariel Correa Sierra, Consuelo Muné Jiménez, Mayra Kourí Cardellá, Vivian Ramírez Bartutis, Rosa Alfonso Castellanos, Melkis Soto Brito, Yudira |
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| Discipline | Medicine |
| DocumentTitleAlternate | Standardization of a real-time polymerase chain reaction system for quantification of human herpesvirus 8 |
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| Issue | 2 |
| Keywords | Cuba herpesvirus humano 8 reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real real-time polymerase chain reaction sarcoma de Kaposi Karposi´s sarcoma human herpes virus 8 |
| Language | Portuguese Spanish |
| License | This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License. http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0 |
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| PublicationCentury | 2000 |
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| PublicationDecade | 2000 |
| PublicationTitle | Revista cubana de medicina tropical |
| PublicationTitleAlternate | Rev Cubana Med Trop |
| PublicationYear | 2009 |
| Publisher | Centro Nacional de Información de Ciencias Médicas |
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| References | Gulley, ML; Fan, H; Elmore, SH 2006; 8 Durtschi, JD; Stevenson, J; Hymas, W; Voelkerding, KV 2007; 361 Ellison, SL; English, CA; Burns, MJ; Keer, JT 2006; 6 Mackay, IM; Arden, KE; Nitsche, A 2002; 30 Bustin, SA 2000; 25 Bernard, PS; Wittwer, CT 2002; 48 Wada, K; Kubota, N; Ito, Y; Yagasaki, H; Kato, K; Yoshikawa, T 2007; 45 Rose'Meyer, RB; Mellick, AS; Garnham, BG; Harrison, GJ; Massa, HM; Griffiths, LR 2003; 11 Speers, DJ 2006; 27 Saikaly, PE; Barlaz, MA; de Los Reyes, FL 2007; 73 Yun, JJ; Heisler, LE; Hwang, II; Wilkins, O; Lau, SK; Hyrcza, M 2006; 34 Niesters, HG 2001; 25 Dijkstra, D; Leurs, R; Chazot, P; Shenton, FC; Stark, H; Werfel, T 2007; 120 Espy, MJ; Uhl, JR; Sloan, LM; Buckwalter, SP; Jones, MF; Vetter, EA 2006; 19 Watzinger, F; Ebner, K; Lion, T 2006; 27 Parisi, SG; Cruciani, M; Palu, G 2007; 356 Bakker, NA; Verschuuren, EA; Veeger, NJ; van der Bij, W; van Imhoff, GW; Kallenberg, CG 2008; 27 Valasek, MA; Repa, JJ 2005; 29 Pfaffl, MW; Bustin, SA 2004 Larionov, A; Krause, A; Miller, W 2005; 6 Kuhne, BS; Oschmann, P 2002; 33 Hengge, UR; Ruzicka, T; Tyring, SK; Stuschke, M; Roggendorf, M; Schwartz, RA 2002; 2 Watzinger, F; Suda, M; Preuner, S; Baumgartinger, R; Ebner, K; Baskova, L 2004; 42 Payan, C; Ducancelle, A; Aboubaker, MH; Caer, J; Tapia, M; Chauvin, A 2007; 45 |
| References_xml | – start-page: 1 year: 2004 end-page: 20 publication-title: A-Z of quantitative PCR contributor: fullname: Pfaffl, MW; Bustin, SA – volume: 73 start-page: 6557 issue: 20 year: 2007 end-page: 65 article-title: Development of quantitative real-time PCR assays for detection and quantification of surrogate biological warfare agents in building debris and leachate publication-title: Appl Environ Microbiol contributor: fullname: Saikaly, PE; Barlaz, MA; de Los Reyes, FL – volume: 25 start-page: 169 issue: 2 year: 2000 end-page: 93 article-title: Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays publication-title: J Mol Endocrinol contributor: fullname: Bustin, SA – volume: 29 start-page: 151 issue: 3 year: 2005 end-page: 9 article-title: The power of real-time PCR publication-title: Adv Physiol Educ contributor: fullname: Valasek, MA; Repa, JJ – volume: 361 start-page: 55 issue: 1 year: 2007 end-page: 64 article-title: Evaluation of quantification methods for real-time PCR minor groove binding hybridization probe assays publication-title: Anal Biochem contributor: fullname: Durtschi, JD; Stevenson, J; Hymas, W; Voelkerding, KV – volume: 30 start-page: 1292 issue: 6 year: 2002 end-page: 305 article-title: Real-time PCR in virology publication-title: Nucleic Acids Res contributor: fullname: Mackay, IM; Arden, KE; Nitsche, A – volume: 25 start-page: 419 issue: 4 year: 2001 end-page: 29 article-title: Quantitation of viral load using real-time amplification techniques publication-title: Methods contributor: fullname: Niesters, HG – volume: 45 start-page: 897 issue: 3 year: 2007 end-page: 901 article-title: Human papillomavirus quantification in urine and cervical samples by using the Mx4000 and LightCycler general real-time PCR systems publication-title: J Clin Microbiol contributor: fullname: Payan, C; Ducancelle, A; Aboubaker, MH; Caer, J; Tapia, M; Chauvin, A – volume: 19 start-page: 165 issue: 1 year: 2006 end-page: 256 article-title: Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing publication-title: Clin Microbiol Rev contributor: fullname: Espy, MJ; Uhl, JR; Sloan, LM; Buckwalter, SP; Jones, MF; Vetter, EA – volume: 33 start-page: 1078 issue: 5 year: 2002 end-page: 84 article-title: Quantitative real-time RT-PCR using hybridization probes and imported standard curves for cytokine gene expression analysis publication-title: Biotechniques contributor: fullname: Kuhne, BS; Oschmann, P – volume: 48 start-page: 1178 issue: 8 year: 2002 end-page: 85 article-title: Real-Time PCR Technology for Cancer Diagnostics publication-title: Clinical Chemistry contributor: fullname: Bernard, PS; Wittwer, CT – volume: 11 start-page: 9 issue: 1 year: 2003 end-page: 18 article-title: The measurement of adenosine and estrogen receptor expression in rat brains following ovariectomy using quantitative PCR analysis publication-title: Brain Res Brain Res Protoc contributor: fullname: Rose'Meyer, RB; Mellick, AS; Garnham, BG; Harrison, GJ; Massa, HM; Griffiths, LR – volume: 8 start-page: 589 issue: 5 year: 2006 end-page: 97 article-title: Validation of Roche LightCycler Epstein-Barr virus quantification reagents in a clinical laboratory setting publication-title: J Mol Diagn contributor: fullname: Gulley, ML; Fan, H; Elmore, SH – volume: 120 start-page: 300 issue: 2 year: 2007 end-page: 7 article-title: Histamine downregulates monocyte CCL2 production through the histamine H4 receptor publication-title: J Allergy Clin Immunol contributor: fullname: Dijkstra, D; Leurs, R; Chazot, P; Shenton, FC; Stark, H; Werfel, T – volume: 27 start-page: 254 issue: 2-3 year: 2006 end-page: 98 article-title: Detection and monitoring of virus infections by real-time PCR publication-title: Mol Aspects Med contributor: fullname: Watzinger, F; Ebner, K; Lion, T – volume: 356 start-page: 87 issue: 1 year: 2007 end-page: 9 article-title: Transmission of human herpesvirus 8 by blood transfusion publication-title: N Engl J Med contributor: fullname: Parisi, SG; Cruciani, M; Palu, G – volume: 27 start-page: 39 year: 2006 end-page: 51 article-title: Clinical Applications of Molecular Biology for Infectious Diseases publication-title: Clin Biochem Rev contributor: fullname: Speers, DJ – volume: 6 start-page: 33 year: 2006 article-title: Routes to improving the reliability of low level DNA analysis using real-time PCR publication-title: BMC Biotechnol contributor: fullname: Ellison, SL; English, CA; Burns, MJ; Keer, JT – volume: 2 start-page: 281 issue: 5 year: 2002 end-page: 92 article-title: Update on Kaposi's sarcoma and other HHV8 associated diseases. 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