奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶多克隆抗体的制备和鉴定
目的 表达、纯化奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶(PPK)蛋白,制备PPK多克隆抗体.方法 利用分子生物学软件分析奇异变形杆菌PPK的抗原性、疏水性等参数,选取N端较保守的309个氨基酸,并对其基因序列进行密码子优化以利于原核表达.合成新的基因序列后插入pET28b(+)质粒,转化入转化宿主菌BL21(DE3),诱导、表达融合蛋白.通过镍琼脂糖亲和层析技术,将获得的融合蛋白进行纯化.以纯化的蛋白作为免疫原并结合使用佐剂,背部多点注射新西兰大白兔,ELISA检测兔血清效价,Western Blotting验证抗体特异性.结果 成功构建了奇异变形杆菌PPK的原核表达重组质粒,可在0.5 mmol/L IP...
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| Published in: | 南方医科大学学报 Vol. 37; no. 3; pp. 312 - 316 |
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| Main Authors: | , , , , , |
| Format: | Journal Article |
| Language: | Chinese |
| Published: |
广州医科大学附属第二医院检验科,广东广州,510260%广州医科大学附属第二医院血液科,广东广州,510260%南方医科大学公共卫生学院//广东省热带病研究重点实验室,微生物学系,广东广州510515
2017
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| Subjects: | |
| Online Access: | Get full text |
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| Summary: | 目的 表达、纯化奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶(PPK)蛋白,制备PPK多克隆抗体.方法 利用分子生物学软件分析奇异变形杆菌PPK的抗原性、疏水性等参数,选取N端较保守的309个氨基酸,并对其基因序列进行密码子优化以利于原核表达.合成新的基因序列后插入pET28b(+)质粒,转化入转化宿主菌BL21(DE3),诱导、表达融合蛋白.通过镍琼脂糖亲和层析技术,将获得的融合蛋白进行纯化.以纯化的蛋白作为免疫原并结合使用佐剂,背部多点注射新西兰大白兔,ELISA检测兔血清效价,Western Blotting验证抗体特异性.结果 成功构建了奇异变形杆菌PPK的原核表达重组质粒,可在0.5 mmol/L IPTG、37℃条件下获得较好的诱导、表达;利用镍柱纯化后的PPK蛋白与免疫佐剂一起,采用背部多点接种新西兰大白兔,制备了效价高的兔抗血清.ELISA检测血清效价达到1∶512 000,Western Blotting对ppk基因缺失株及其野生株进行验证显示抗体特异性良好.结论 利用pET28b(+)载体可构建奇异变形杆菌PPK的原核表达重组质粒,表达、纯化后的蛋白与佐剂共同免疫新西兰大白兔,可获得效价高、特异性良好的兔多克隆抗体血清,为奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶的检测以及深入研究PPK在奇异变形杆菌致病中的作用奠定了基础. |
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| ISSN: | 1673-4254 |
| DOI: | 10.3969/j.issn.1673-4254.2017.03.06 |